胶质母细胞瘤（GBM） 是最致命的中枢神经系统癌症，部分原因是未能对抗治疗耐药性。GBM 中 midkine（MDK） 的上调加速了化疗药物（如替莫唑胺（TMZ））引起的 DNA 损伤的修复。尽管 RNA 干扰（RNAi） 和 CRISPR-Cas9（CRISPR（成簇规则间隔短回文重复序列））基因编辑技术是有吸引力的方法，但它们的实施具有挑战性。这是因为以活性形式静脉内（i.v.）递送短干扰 RNA （siRNA） 或 CRISPR-Cas9 核糖核蛋白（RNP）复合物涉及一个复杂的三步过程。生物制品必须（i）进入目标细胞，通常通过内吞作用；（ii）从内溶酶体逃逸进入细胞质；以及（iii）从其载体中释放。在步骤（ii）中，生物制品从内溶酶体逃逸通常很低。此外，几个生理障碍，特别是血脑屏障（BBB），仍然需要克服以实现脑内递送。
 

     研究人员证明了聚合物锁定融合脂质体（表示为 Plofsomes），它可以跨 BBB 运输并将 siRNA 和 CRISPR-Cas9 RNP 复合物递送到 GBM 细胞的细胞质中。通过使用无痕修饰方法将四臂聚乙二醇-邻位二酚 （4-arm PEG-oDP） 锚定到 Angiopep-2（Ang）修饰的融合脂质体的表面上来制备 Plofsome。由于 GBM 组织中的 ROS 水平高，因此选择了无痕活性氧 （ROS） 可切割接头元。Ang 是低密度脂蛋白受体相关蛋白1（LRP-1） 的特异性配体，在 BBB 内皮细胞和 GBM 细胞中高度表达。研究人员选择融合脂质体作为核心结构，因为它们具有出色的胞质递送性能。具体来说，药物内化和释放同时发生，简化了给药过程。此外，由融合脂质体递送的药物绕过内溶酶体途径，从而防止溶酶体降解。然而，融合脂质体在脑靶向药物递送方面存在严重缺陷。它们通过与脑内皮细胞融合来穿过 BBB，这会导致脂质体在进入大脑之前解体。在这种情况下，虽然生物制剂被输送到大脑，但它们通常以裸露状态存在，导致细胞内化效率低下。为了解决这个问题，研究人员将“锁”整合到融合脂质体上，以便仅在穿过 BBB 并进入 GBM 组织后发生融合。4-arm PEG-oDP作为锁，通过修饰Ang修饰的融合脂质体表面来获得Plofsome。Plofsomes在血液循环中以及在穿越BBB期间保持非融合状态。进入大脑后，Plofsomes被肿瘤组织中过表达的ROS（过氧化氢）刺激，导致4-arm PEG-oDP脱落，使Plofsomes变得具有融合性。类似于只有在解锁时才能打开的保险箱，Plofsomes仅与目标细胞融合，并在高过氧化氢水平的环境中释放其有效载荷。MDK被选为治疗靶点。研究结果表明，Plofsomes有效地将siMDK或CRISPR-Cas9 RNP复合物递送至GBM细胞质中。结果，通过Plofsome配方抑制MDK减少了TMZ抵抗性，并抑制了原位脑肿瘤模型中的GBM生长。

图1：Plofsomes用于GBM靶向siRNA递送和CRISPR-Cas基因编辑。

MDK 促进 TMZ 耐药和 GBM 细胞的进展 

      首先对患者来源的组织进行了单细胞 RNA 测序 （scRNA-seq）, 并通过细胞标志物注释癌细胞。与其他细胞类型相比，GBM 细胞中的 MDK 表达显着升高。免疫组化(IHC)进一步证实了这一点，显示WHO 4级GBM组织中MDK表达更高，导致肿瘤恶性程度增加。通过分析不同数据集，研究人员确定了31个与TMZ耐药性和GBM恶性进展相关的基因，其中MDK表达上调与患者生存率下降显著相关。实验结果显示，TMZ治疗对TMZ耐药的GBM细胞形成的肿瘤无效，且这些肿瘤组织中MDK表达增加。

图 2：MDK 促进 TMZ 耐药和GBM 细胞的恶性进展。

Plofsomes 的制备和表征

      研究人员成功制备了一种新型融合脂质体Plofsomes，通过将4-(羟甲基)苯基硼酸(HPBA)和4臂聚乙二醇-邻二酚(4-arm PEG-oDP)进行可触发降解修饰，实现了表面涂层。Plofsomes的粒径约为120 nm，Plofsomes 的 zeta 电位为 +6.1 ± 0.7 mV，Plofsomes 的透射电子显微镜 （TEM） 图像显示，它们具有具有双层结构的封闭囊泡形态。在H2O2刺激下，Plofsomes的HPBA部分发生氧化和水解，导致4-arm PEG-oDP脱落，从而触发脂质体的不稳定性并恢复其融合性。通过FRET实验，研究人员观察到4-arm PEG-oDP的存在调节了脂质体的脂质分子侧向流动性，影响其结构稳定性。这种设计使Plofsomes在GBM组织中因高ROS水平而表现出与血液中不同的特性，有助于提高药物递送效率。

图 3：Plofsomes 的表征

使用 Plofsome 将 siRNA 递送到 GBM 细胞细胞质中 

      接下来，研究人员研究了Plofsomes与GBM细胞融合的能力，发现在H2O2存在下，Plofsomes能与GBM细胞融合，而没有H2O2时则主要定位于细胞内溶酶体。通过共聚焦激光扫描显微镜（CLSM）观察，证实了Plofsomes在H2O2处理后能将siRNA释放到细胞质中。此外，Plofsomes展现出良好的生物相容性，并通过膜融合而非内吞作用进入细胞。在体外BBB模型中，Plofsomes能有效穿越BBB，并在模拟的ROS环境中与GBM细胞融合，释放siRNA。相比之下，未加H2O2处理的Plofsomes主要通过内吞作用进入细胞。实验结果表明，Plofsomes在H2O2刺激下能够特异性地与GBM细胞融合并释放其内容物，而未处理的Plofsomes则保持稳定。

图 4：Plofsomes 在接受 H2O2时与质膜融合刺激并将 siRNA 递送到细胞质中。

使用 Plofsome@siMDK 抑制 MDK 抑制 GBM 生长 

      紧接着，研究人员利用表达荧光素酶（Luc）的LN229R细胞测试了Plofsomes对基因沉默的效果，发现在H2O2存在下，Plofsome@siLuc能显著降低Luc表达，其效率与FL@siLuc相当。进一步研究发现，Plofsome@siMDK能在H2O2存在时有效降低MDK表达，并通过EdU实验和集落形成实验证实了其抗肿瘤活性。在体外BBB模型中，Plofsome@siMDK能有效降低GBM细胞中的MDK表达，而FL@siMDK则效果不佳。此外，Plofsome@siMDK处理减少了LN229R细胞的增殖，且在bEnd.3细胞中未引起明显的MDK沉默，显示出良好的安全性。

GBM 靶向 Plofsome@siMDK 及其抗肿瘤活性 

      研究人员建立LN229R肿瘤裸鼠模型，发现Plofsome@Cy5-siRNA能高效穿越BBB，且在肿瘤组织中表达更高。Plofsome@siMDK能有效沉默MDK基因，与TMZ联合使用时，显著抑制了GBM肿瘤的生长，并且提高了小鼠的生存率。Plofsome@siMDK的治疗效果优于单独使用TMZ或与其他siMDK配方联合使用。此外，Plofsome@siMDK在抑制肿瘤细胞增殖和DNA损伤修复方面也表现出色，且其基因沉默特异性高，不影响正常组织。

图 5：Plofsome@siRNA 在原位 LN229R-Luc 荷瘤小鼠模型中的抗肿瘤疗效。

结论： 

      研究人员开发了一种Plofsome，可以穿过血脑屏障，将siRNA和CRISPR-Cas9-RNP复合物递送到GBM细胞的细胞质中。具体来说，研究人员使用可触发降解的ROS可切割接头将4-arm PEG-oDP整合到脑靶向融合脂质体中，以构建Plofsomes。Plofsome在血液循环和BBB跨越过程中都保持非融合状态。进入大脑后，Plofsome受到GBM组织中过表达的ROS的刺激，从而分离出4-arm PEG-oDP并变得融合。这种设计确保了只有在进入GBM组织后才能进行靶向融合和货物释放。MDK基因促进TMZ抗性。研究结果表明，Plofsomes有效地将siMDK和CRISPR-Cas9-RNP复合物递送到GBM细胞的细胞质中。在原位脑肿瘤模型中，有效的MDK抑制导致TMZ耐药性和GBM生长抑制显著降低。至关重要的是，Plofsomes仅在ROS水平较高的肿瘤部位有效，而在正常脑组织中无效，这增强了RNAi或CRISPR-Cas9联合治疗对TMZ耐药性的安全性。  

原文链接;https://www.nature.com/articles/s41565-024-01769-0